禽流感（ＡＩ）是由Ａ型流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的感染和／或疾病综合症。禽流感病毒属正黏病毒科流感病毒属，典型病毒粒子为球形，直径８０～１２０ｎｍ，有时呈丝状体等形态。至今已发现Ａ型流感病毒的血凝素（ＨＡ）有１６种，神经氨酸酶（ＮＡ）有９种（傅生芳，２００５），根据表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ的抗原性差异可以分为１６个ＨＡ亚型和９个ＮＡ亚型，不同亚型病毒之间可以通过交换某些基因片段发生基因重排，出现具有新的生物学特征的病毒，因此，ＡＩＶ 最显著的生物学特征之一就是亚型众多。而且，不同亚型或血清型之间无交叉反应性或反应性低，这使得禽流感的诊断监测工作较为困难。禽流感根据ＡＩＶ致病力的强弱可分为高致病性（ＨＰＡＩＶ）和低致病性（ＬＰＡＩＶ），前者不仅可以引起家禽死亡，还可以造成人的感染死亡，因此，控制ＡＩＶ的发生和流行具有重要意义。文章就禽流感近几年的研究，尤其是在病原学检测、免疫分

析方法和分子生物学检测方法的研究进行了综述。
 

１　病原学检测

１．１　病毒的分离鉴定
ＡＩＶ 在鸡胚中生长良好，将疑似病料经适当处理接种在９～１０日龄的鸡胚中，分离培养病毒。若检测出有凝血活性，可进一步确定分型；若无凝血活性，则认为未分离到病毒（赵翠燕等，２００３），该方法具有精确、敏感的优点，但操作繁琐，耗时较长，需要１周左右的时间。
 

１．２　电镜技术　
利用电镜技术可以直观准确地鉴别病毒，根据病毒自身的形态、结构等不同特征，能很快做出诊断。检验结果与样品制备技术、收取病料的部位和时间有关，电镜法不能用于亚型及致病性的测定且其受到设备的限制，投入资金较大（刘志杰等，２０１１）

２　免疫分析技术

２．１　免疫传感技术　
随着生物传感器的飞速发展，出现了生物传感器微阵列、微系统，该技术灵敏度高、响应快，不需要标记，既可定性又可定量，克服了传统检测方法费时、昂贵、标记及操作繁琐等缺点，具有极广泛的发展前景及临床使用价值，成为生物传感器领域的研究热点（姚春艳等，２００６）。免疫识别膜的固定化技术是生物传感器制作的核心部分，其固定化技术决定着生物传感器的选择性、灵敏度、稳定性和寿命等主要性能，也决定着生物传感器是否有研究和应用价值。詹爱军等（２００９）将石英晶片谐振的高灵敏度与免疫反应的特异性相结合，用蛋白Ａ（ＳＰＡ）在镀金膜的石英晶体电极偶联抗Ｈ９亚型流感病毒的单抗构建传感器探头形成免疫传感器。检测结果表明，该方法具有较好的特异性，不与Ｈ５亚型禽流感病毒和新城疫病毒（ＮＤＶ）反应，检测灵敏度达到２０ＥＩＤ５０，组成的检测器对相应的流感病毒响应良好，该法与鸡胚病毒分离法检出流感病毒的符合率达到９１％。林向华等（２００９）以ＡＴ切型、基频１０ＭＨｚ的石英晶体为材料，设计四通道芯片微阵列。采用聚乙烯亚胺黏附—戊二醛交联法

将禽流感Ｈ５、Ｈ９亚型单克隆抗体固定在石英晶体的金膜电极表面制备生物敏感膜，构建可用于同步检测禽流感Ｈ５、Ｈ９亚型的压电免疫芯片。构建的压电免疫芯片用于检测Ｈ５、Ｈ９亚型抗原和疑似样品，其各自的响应值与空白对照的噪声值之比均大于２，试验构建的压电免疫芯片可用于禽流感Ｈ５、Ｈ９亚型的定性检测。
 

２．２　蛋白质芯片技术　
蛋白质芯片技术是一种高通量、高灵敏度、自动化的蛋白质分析技术，在蛋白质组的功能研究、疾病诊断及药物开发中显示出巨

大的应用潜力（Ｓａｎｇ等，２００８）。石霖等（２００９）制备了可以同时鉴别诊断禽流感（ＡＩ）、新城疫（ＮＤ）２种

禽病血清抗体的可视化蛋白质芯片，将芯片与待检血清杂交后，再与胶体金标记的二抗杂交，银染显色后根据灰度值判定结果，该可视化蛋白质芯片具有很好的特异性，?Z?X暅 并且检测灵敏度是琼脂糖凝胶扩散（ＡＧＰ）方法的４００倍以上。研究结果表明，该方法可用于同步鉴别两种禽病，是一种有效的抗体检测新方法。该技术不仅保留了抗原—抗体反应快速、灵敏和特异性的特点，还可以满足生物样本多指标分析的需要，因此更利于大规模推广应用（Ｓｍｉｔｈ等，２００６）。
 

２．３　胶体金免疫层析法　
陈洪等（２００７）用胶体金颗粒标记Ｈ５ 亚型禽流感病毒单克隆抗体Ａ（Ｂ５Ｃ７），用羊抗鼠ＩｇＧ和Ｈ５亚型禽流感病毒单克隆抗体Ｂ（３Ｃ４）喷涂于硝酸纤维膜质控线和检测线上，研制出Ｈ５亚型禽流感病毒抗原金标快速诊断试纸条。用禽流感Ｈ
５、Ｈ９标准抗原和新城疫标准抗原作为检测抗原对研制的试纸条进行特异性、敏感性和稳定性试验，试验结果表明该方法操作简单、灵敏度高、特异性强、稳定性好，具有良好的应用前景。单抗介导的斑点免疫金渗滤法（ＤＩＧＦＡ）是利用Ａ型禽流感单克隆抗体和胶体金标记技术建立的快速检测ＡＩＶ方法。敏感性高于ＨＡ诊断方法，２０～３０ｍｉｎ即可出结果，ＤＩＧＦＡ 具有不需试验设备、可用肉眼判定、方法简便、试剂用量少、对人体无害等优点（雷彩侠，２００７）。

２．４　荧光抗体试验
免疫荧光技术（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ，ＩＦＡ）是利用被标记上荧光色素的抗原（或抗体）特异性地与抗体（或抗原）结合，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应来进行观察的检测方法。最早用于鉴定ＡＩＶ 的ＮＰ和ＭＰ抗原，１９６１年开始用于人类流感的快速诊断。秦爱建等（２００３）研制了抗禽流感Ｈ５和Ｈ９亚型病毒的单克隆抗体，建立了免疫荧光方法检测ＡＩＶ，可以检测出相应的Ｈ５亚型病毒。建立在单克隆抗体基础上的免疫荧光方法具有快速、简便、易行、较敏感等特点，也常用于临床诊断，但出现假阳性的几率较高。

２．５　单克隆抗体技术　
李娜等（２００７）利用禽流感Ｈ９亚型病毒（ＡＩＶ－Ｈ９）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得了５株特异性抗ＡＩＶ核蛋白的单克隆抗体细胞株。这５株单克隆抗体能与所有试验的ＡＩＶ－Ｈ９病毒反应，Ｗｅｓｔｅｒｎ

ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法鉴定结果表明，单克隆抗体仅识别６０ｋｕ的蛋白抗原，而不与新城疫病毒、禽网状内皮组织增殖症病毒、传染性法氏囊病毒等反应。初步应用结果显示，以这些单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验或ＥＬＩＳＡ方法可迅速检测出禽流感病毒，这些单克隆抗体在禽流感的预防监测中将发挥重要的作用。
 

２．６　酶联免疫吸附试验技术
酶联免疫吸附试验技术（ＥＬＩＳＡ）创立于１９７１年，１９７４年Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等首先用ＥＬＩＳＡ对注射流感病毒所产生的抗体消长规律进行了检测。ＥＬＩＳＡ具有较高的敏感性，既可以检测抗体，又可以检测抗原，且结果易于分析，在流感的控制、扑灭和检疫中用途很大。Ｗｕ 等（２００７）运用表达的核蛋白（ＮＰ）建立了禽流感抗体定量间接ＥＬＩＳＡ检测技术。目前，国内外已经有成熟的禽流感抗原抗体检测试剂盒出售，在ＡＩＶ流行病学普查及早期诊断上起到了重要的作用。李海燕

等（１９９９）在禽流感全病毒酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和斑点ＥＬＩＳＡ研究的基础上，建立了以杆状病毒系统表达的ＡＩＶ 核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（ＲＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。此法不仅具有与ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ 同样的特异性和敏感性，而且具备了抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本价廉、易于生产等优点。
 

２．７　琼脂凝胶扩散试验　
琼脂凝胶扩散试验（ａｇａｒｇｅｌｉｍｍｕｎｏｄｆｆｕｏｎ，ＡＧＩＤ）是一种定性的检测方法，操作简便，不需要特殊设备，且有较好的特异性和检出率。唐松元等（２００７）采用ＡＧＰ检测珍稀雉类患疑似禽流感病１８例，阳性检出率１００％，用ＨＡ、ＨＩ验证试验符合率为１００％，从而建立一种简易、快速、准确的诊断方法，为快速检测本病提供可靠依据。
 

２．８　乳胶凝集试验
乳胶凝集试验（ＬＡＴ）主要用来检测ＩｇＭ 抗体，其特点敏感性不如经典的ＨＩ试验，但由于不需要较高的试验技术和特定的仪器设备，简单、快速，可方便地用于临床诊断和生产实践。喻正军等（２００５）以羧化的聚苯乙烯乳胶为载体，采用了共价偶联的技术，经双功能试剂将ＡＩＶ的ＨＡ抗原表达产物和羧基化的乳胶共价偶联起来，对血清中特异性ＨＡ抗体进行检测，克服了蛋白质致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定，致敏抗原上的蛋白质容易脱落等缺点。此外，血凝及血凝抑制试验（ＨＡ，ＨＩ）简单、快速、特异性好，但敏感性较差，主要用于ＡＩＶ 亚型鉴定和病毒分离鉴定的辅助手段，不能直接检测组织液和分泌液中的病毒，并且需要排除新城疫病毒、腺病毒等的干扰，且不能检出病毒新的ＨＡ亚型。神经氨酸酶抑制试验（ＮＩＴ）主要用于ＡＩＶ 的表面抗原神经氨酸酶的亚型鉴定，虽不能提供常量法的定量，但却是Ａ型流感病毒的分类和抗体检测的快捷方法，被世界卫生组织推荐用于ＮＡ 亚型的分类（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，２００８fs19 ）。ＮＩＴ成本较低且有可重复性，但试验繁琐，不易掌握，易受病毒ＨＡ抗体的干扰（任丽伟等，２００９）。病毒中和试验（ＮＴ）是最敏感且特异的血清学方法，检出率也相当高，虽然它的操作繁琐且耗时，但它高度的特异性是公认的，很多新的检测方法都要以之为标准来进行比较（杨帆，２００７）。
 

３　分子生物学技术

３．１　ＲＴ－ＰＣＲ技术　
ＲＴ－ＰＣＲ技术从基因水平检测ＡＩＶ　ＲＮＡ基因，具有高度敏感性和特异性，大大缩短了对ＡＩＶ 的检出时间。１９８６年，Ｐｅｒｄｕｅ用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）诊断禽流感，从接种鸡胚到获得结果仅需６ｈ，大大缩短了禽流感的诊断时间（廉

慧锋等，２００４）。国内学者陈思怀等（２００６）针对ＮＰ（型诊断）、ＨＡ（亚型诊断）基因设计２对引物，从而

对Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９亚型ＡＩＶ 做快速检测。马鸣潇等（２００５）针对Ｈ５和Ｈ９两个亚型，各设计一套特异性的引物，建立了ＲＴ－ＰＣＲ一步法，用于Ｈ５和Ｈ９亚型的鉴别。谢芝勋等成功建立了快速检测鉴别ＡＩＶ　Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９亚型的多重ＲＴ－ＰＣＲ方法，对ＡＩＶ不同亚型ＲＮＡ的最低检测量为１０ｐｇ，不需要对病原体进行分离增殖就可对临床疑似ＡＩＶ 感染

的样品或环境样品进行直接检测和鉴别，避免了进行ＡＩＶ分离增殖过程中散毒和传播等风险（庞耀珊等，２００５；Ｃｈｅｎ等，２００８）。
 

３．２　生物传感技术　
传感器在流感上的应用最初见于２０世纪９０年代，生物传感器技术的发展能迅速和具体诊断本病，使临床工作者能迅速确定是否

治疗（Ａｍａｎｏ等，２００５）。时伟杰等（２００９）将Ｇ４ＰＡＭＡＭ 固定在玻碳电极表面，然后通过共价作用固定禽流感病毒探针ｓｓＤＮＡ－１，以［Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３］３＋为指示剂，采用示差脉冲伏安法和交流阻抗法对ＤＮＡ电化学生物传感器进行了表征。研究结果发现，通过与双链ｄｓＤＮＡ作用的［Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３］３＋ 的峰电流信号的变化，可以识别和定量检测溶液中互补的禽流感病毒ＤＮＡ 片段。经过条件优化，该法测定ＤＮＡ的浓度线性范围为１．３×１０－９～６．５×１０－８ｍｏｌ／Ｌ，最低检测限为９．２×１０－１０　ｍｏｌ／Ｌ。
 

３．３　基因芯片分型技术　
芯片技术是融生物学、物理学、化学、计算机科学和微电子学一体的高度交叉的新技术。将大量的核酸分子以大规模阵列形式排

布在很小的载玻片等载体上，通过与标记的样品进行杂交，检测杂交信号的强弱进而判断样品中被检分子的数量。曹三杰等（２００６）制备的ＮＤＶ－ＩＢＶＡＩＶ－ＩＢＤＶ诊断基因芯片质量好，可对ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＡＩＶ和ＩＢＤＶ 进行诊断检测，具有检测灵敏性好，特异性高和芯片可重复检测的优点。试验对３０个临床样品进行初步应用检测，结果表明该诊断基因芯片技术与ＲＴ－ＰＣＲ检测技术检出率基本一致，并具有同步诊断检测多种疫病的优点。Ｘｕｅ等（２００８）通过设计ＡＩＶ　２５个特异性引物和１个通用引物，经ＲＴ－ＰＣＲ 或重叠ＰＣＲ 扩增了这２５ 个亚型的ｃＤＮＡ，研制出了一种能检测禽流感１６个ＨＡ和９个ＮＡ的ＤＮＡ芯片。由于基因芯片技术特异、敏感且允许同时扫描成百上千的核苷酸序列，已成为一种具有巨大潜能的禽流感诊断方法。国际上已经有关于基因芯片技术在流感亚型鉴别上应用的报道，直接检测流感病毒的ｃＤＮＡ技术将作为流感病

毒亚型鉴别的一种新途径（王秀荣等，２００５）。
 

３．４　核酸依赖的扩增　
核酸依赖的扩增（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＮＡＳＢＡ）是一种连续、等温、基于恒温反应的核酸扩增技术。该技术使用３种（禽类成肌细胞增多症病毒反转录、核糖核酸Ｈ、噬菌体Ｔ７核糖核酸聚合酶）和２种特别设计的寡核酸引物。上游引物５′末端包含有噬菌体Ｔ７的依赖于ＤＮＡ的ＲＮＡ聚合的启动子序列，下游引物的５′末端包含有和钌标电化学发光检测探针（ＥＣＬ　Ｐｒｏｂｅ）互补的序列。在扩增步骤中，两个５′端都整合进扩增序列中，从而高效率生产出互补ＲＮＡ序列的模板。该技术特点是整个扩增过程在恒温条件下进行，不受背景中ＤＮＡ的干扰，不易发生交叉污染，扩增效率高于ＰＣＲ，特异性好，不需要特殊（如ＰＣＲ仪）的控温装置，检测禽流感群特异性毒株（Ｈ１、Ｈ１５）（ＮＡＳＢＡ－ＡＩＶ）、Ｈ５亚型（ＮＡＳＢＡＨ５）、Ｈ７亚型（ＮＡＳＢＡ－Ｈ７）的ＮＡＳＢＡ／ＥＣＬ检测

试剂盒，与现行的病毒培养检测方法的灵敏度相当，可以同时检测５０个样本，进行大规模检样（刘乐庭，２００５）。目前已标准化的有《Ｈ５亚型禽流感病毒ＮＡＳＢＡ检测方法》和《禽流感病毒ＮＡＳＢＡ检测方

法》。
 

３．５　环介导逆转录等温扩增技术
随着分子生物学的发展和不断对传统核酸扩增技术的改进，Ｎｏｔｏｍｉ等（２０００）首先报道了一种新的核酸扩增技术，

即环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）。该技术利用两对特殊引物和有链置换活性的Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条

件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。谢青梅等（２０１０）根据ＨＡ 基因保守区的序列，设计４条特异性引物进行核酸扩增，扩增后产物加入核酸染色剂ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ和４ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋，结果可视。扩增产物可用特异性内切酶ＫｐｎⅠ进行酶切鉴定。用已建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技术检测临床样品，检测结果与ＲＴ－ＰＣＲ 方法一致。ＲＴＬＡＭＰ技术整个检测过程只需１～２ｈ，不需要ＰＣＲ仪和成像系统，仅需要恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验，验证了建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技术可以作为一种操作简单，灵敏性、特异性高的检测Ｈ５亚型禽流感病毒的方法。
 

３．６　核酸探针技术　
核酸探针技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一，是定性和定量检测特异性ＤＮＡ 或ＲＮＡ 的有力工具。

黄庚明等（２００１）利用ＰＣＲ技术建立并优化了检测ＡＩＶ核蛋白片段（ＮＰＣ）的地高辛标记的ｃＤＮＡ 探针杂交法。该探针有较好的特异性和敏感性，为从分子水平探讨ＡＩ的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。

４结语

目前，禽流感病毒的实验室诊断主要从两方面着手：①针对病原进行诊断；②针对病原产生的特异性抗体进行诊断。由于病原的特异性抗体产生时间较长，有时急性病例的家禽在濒死前还检测不到其特异性抗体。随着核酸扩增技术的出现及其不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法具有更为准确、灵敏、特异的特点，完全可用于早期快速诊断目的，并具有其自身独特的优势和广阔的应用前景。
 

现代试验诊断技术向两个方向发展：①配备有高性能技术设备的中央检验，②无需特殊技术和仪器的现场快速检验（ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　ｃａｒｅ　ｔｅｓｔ，ＰＯＣＴ）（杨继琼，２００８）。无疑对ＡＩＶ 的初步筛选和鉴定可用ＰＯＣＴ方法，比如ＡＩＶ的胶体金诊断试纸条进行，这部分工作可在养殖场或疫情暴发地进行，而对于ＡＩＶ重大疫情的确诊则要依靠技术设备先进的中

央检验来完成。随着公众对ＡＩＶ 防制意识的加强和试验诊断及疫苗研制技术的发展，对ＡＩＶ的早期诊断和及时治疗是有可能实现的。